Tečna hromatografija visokih performansi
 HPLC. Sa leva na desno: Uređaj za pumpanje formira gradijent dva različita rastvarača, čelikom pojačana kolona i aparat za merene apsorbance. | |
| Akronim | HPLC |
|---|---|
| Klasifikacija | Hromatografija |
| Uzorci | organski molekuli biomolekuli joni polimeri |
| Druge tehnike | |
| Srodno | Hromatografija Hromatografija vodene normalne faze Hromatografija sa hidrofilnim interakcijama Jonoizmenjivačka hromatografija Ekskluziona hromatografija Micelarna elektrokinetička hromatografija |
| Pun naziv | Tečna hromatografija-masena spektrometrija |
Tečna hromatografija visokih performansi (HPLC, tečna hromatografija pod visokim pritiskom) je oblik kolonske hromatografije koji se često koristi u analitičkoj hemiji. HPLC se koristi za razdvajanje komponenti iz smese na osnovu hemijskih interakcija između supstance koja se analizira i stacionarne faze u koloni.[1][2][3][4][5]
Princip rada HPLC-a je forsiranje prolaska analizirane supstance (ili smeše) kroz kolonu (cev napunjenu materijalom sitnih čestica, a time i velike površine) pumpanjem tečnosti (mobilna faza) pod visokim pritiskom kroz kolonu. Unosi se mala zapremina uzorka u tok mobilne faze i na osnovu specifičnih hemijskih i fizičkih interakcija, dolazi do različitog zadržavanja komponenata smeše. Vreme zadržavanja zavisi od prirode supstance koja se analizira, stacionarne faze i sastava mobilne faze. Vreme za koje se supstanca eluira (dođe do kraja kolone) naziva se retenciono vreme i one je karakteristično za određenu supstancu. Korištenje visokog pritiska povećava linearnu brzinu i daje komponentama manje vremena za zadržavanje, što poboljšava rezoluciju hromatograma. Koriste se uobičajeni rastvarači, čisti ili u bilo kojoj kombinaciji (npr. voda, metanol, organski rastvarači, itd). Voda može sadržavati i neki pufer, kako bi se poboljšalo razdvajanje. Moguće je koristiti i gradijentno eluiranje, što podrazumeva promenu sastava mobilne faze u toku eluiranja.
Ova metoda koristi polarnu stacionarnu fazu i nepolarnu mobilnu fazu, a koristi se kada je supstanca koja se analizira polarna. Polarna supstanca se adsorbira i zadržava na česticama stacionarne faze. Jačina adsorpcije je veća, što je veća polarnost supstance, a samim time jeće i vreme zadržavanja. Korištenje polarnijih rastvarača u mobilnoj fazi smanjuje retenciono vreme. Ovaj tip hromatografije je napušten 1970-tih sa razvojem HPLC-a na obrnutim fazama, zbog slabe reproducibilnosti, usled promjena na česticama stacionarne faze pod uticajem rastvarača.[6]
HPLC na reverznim fazama (RP-HPLC) koristi nepolarnu stacionarnu fazu i polarnu mobilnu fazu. Najčešća stacionarna faza je silikatna, tretirana sa RMe2SiCl, gde je R alkilna grupa ravnog lanca kao C18H37 ili C8H17. Vreme zadržavanja je duže za manje polarne supstance. Vreme zadržavanja se povećava dodatkom polarnih rastvarača u mobilnu fazu a smanjuje se dodatkom hidrofobnih rastvarača. RP-HPLC funkcioniše na principu hidrofobnih interakcija, koje su rezultat odbijajućih sila između polarnog rastvarača i relativno nepolarne supstance koja se analizira i nepolarne stacionarne faze.
Na brzinu eluiranja utiče pH, zbog mogućnosti promene polarnosti supstance. Zbog toga se često u mobilnu fazu dodaju puferi. Kolone za RP-HPLC ne bi trebalo koristiti sa jakim bazama, zbog mogućnosti razgradnje silikatnih čestica.
Uređaj za HPLC se sastoji od sledećih komponenata:
- Rezervoar mobilne faze
- Pumpa
- Injektor
- Kolona
- Detektor
Detektor ima važnu ulogu da određivanja komponenti koje izlaze iz kolone nakon eluiranja. Detektor generiše električni signal koji je proporcionalan intenzitetu neke osobine mobilne faze ili supstance koja se eluira. Tipovi detektora u HPLC-u su:[7]
- UV-VIS detektor
- Fluorescentni detektor
- Elektrohemijski detektor
- Detektor indeksa loma
- Maseni spektrometar (MS)
- ↑ L. R. Snyder, J.J. Kirkland, and J. L. Glajch, Practical HPLC Method Development, John Wiley & Sons, New York, 1997.
- ↑ S. Ahuja and H. T. Rasmussen (ed), HPLC Method Development for Pharmaceuticals, Academic Press, 2007.
- ↑ S. Ahuja and M.W. Dong (ed), Handbook of Pharmaceutical Analysis by HPLC, Elsevier/Academic Press, 2005.
- ↑ Y. V. Kazakevich and R. LoBrutto (ed.), HPLC for Pharmaceutical Scientists, Wiley, 2007.
- ↑ U. D. Neue, HPLC Columns: Theory, Technology, and Practice, Wiley-VCH, New York, 1997.
- ↑ Lindsay, S. ; Kealey, D. (1987). High performance liquid chromatography. Wiley. from review Hung, L. B.; Parcher, J. F.; Shores, J. C.; Ward, E. H. (1988). „Theoretical and experimental foundation for surface-coverage programming in gas-solid chromatography with an adsorbable carrier gas”. J. Am. Chem. Soc. 110 (11): 1090. DOI:10.1021/ac00162a003.
- ↑ Settle, F.A.: Handbook of instrumental techniques for analytical chemistry, Prentice Hall, 1997, ISBN 0-13-177338-0
